【会议报道】长城检验医学会议前沿技术论坛(会前会)靓点推送(

  ARMS技术利用探针或染料在实时荧光PCR平台上实现对引物扩增的突变序列的检测。探针法较染料法的性好,广为应用。用于检测血浆ctDNA的商品化 ARMS试剂盒有厦门艾德的人类EGFR 基因突变检测试剂盒,罗氏的cobas® EGFR Mutation Test v2,凯杰的therascreen EGFR Plasma RGQ PCR。厦门艾德的人类EGFR 基因突变检测试剂盒可检测29种EGFR热点突变,已获国家药监局(CFDA)的临床应用批准和欧盟ISO13485认证。该试剂盒检测血浆EGFR突变的灵敏度为1.0%,该公司正致力开发新一代super ARMS,其灵敏度有望与dPCR相当。cobas® EGFR Mutation Test v2和therascreen EGFR Plasma RGQ PCR可检测的EGFR位点分别为42和23种。cobas® EGFR Mutation Test v2和therascreen EGFR Plasma RGQ PCR的灵敏度分别为0.5%和1%,这两种试剂盒中EGFR exon19 缺失和 L858R 突变的检测已获美国FDA批准和欧洲CE-IVD认证。有已获得注册的组织KRAS和BRAF等基因突变的检测试剂盒,这些试剂未获批准用于ctDNA的检测。2013年,刘小青等采用厦门艾德的人类EGFR 基因突变检测试剂盒检测86例ⅢB-Ⅳ期NSCLC患者组织和配对血浆的EGFR突变状态。结果显示,组织和血浆EGFR突变的阳性率分别为46.5%(40/86)和31.4%(27/86)。40例组织EGFR突变型的患者中,检测到27例是EGFR突变型,度为67.5%;27例组织EGFR野生型的患者,其血浆均是EGFR野生型,度为100%。厦门艾德血浆EGFR基因突变一代ARMS检测的度较低,但性和阳性预测值高。我们的研究发现,不同ARMS检测方不同。度高,可能会带来检测的假阳性。因此,临床应用过程中需要权衡ARMS法检测的度和性。

  Michael等收集122例Ⅲ-Ⅳ期黑色素瘤患者的石蜡包埋组织和配对血浆,采用ARMS法检测肿瘤组织中的BRAF V600E突变,与组织检测结果相比,质谱法和ARMS法检测ctDNA的阳性一致率分别为76.4%(55/72)和54.2%(39/72), 阴性一致率分别为98%(49/50)和96%(48/50)。

  MALDI-TOF MS核酸检测具有PCR技术的高性,模板浓度要求低、质谱技术的高分辨率和阵列技术的高通量等特点,且无需化学发光、荧光法或其他任何二级标记方法,直接利用质谱峰值定性定量测定。SBE结合MALDI-TOF-MS核酸质谱法可同时检测同一基因或多个不同基因已知的不同热点突变,检测通量较大,操作时间短,成本低,也可定量检测突变丰度。突变基因质谱法检测的度约为0.5%-1%。

  检测系统在完成对于每个微滴或芯片微孔荧光信号的检测后计算突变拷贝数和突变频率。在目标DNA浓度极低的情况下,有突变荧光信号的反应单元数目与突变DNA的拷贝数相当,有野生荧光信号的反应单元数目与野生DNA的拷贝数相当。但少数反应单元中可能包含两个或两个以上的目标。每个反应单元中含某个突变拷贝数的概率符合泊松概率分布函数。

  生理或病理状态下,细胞坏死或凋亡时,核内或线粒体内的DNA 会到血液、胸腔积液、脑脊液、尿液、痰液或粪便中。细胞外游离 DNA(cell-free DNA,cfDNA)是细胞 DNA 的降解产物,片段大小约为 150-200bp。作为 cfDNA 的一类, ctDNA来源于肿瘤细胞,可反映肿瘤的异质性。ctDNA在血液中的半衰期为15min到几个小时,可用于患者治疗反应的实时监测。ctDNA作为组织学基因检测的补充,在指导靶向用药方面显示其潜在的价值,并在肿瘤的早期诊断、评效、残留与复发监测、预后预测等方面也显示其潜在的应用价值。

  根据反应单元总数和检出有突变基因的反应单元数就可以得到每个反应单元中含突变型DNA的平均拷贝数。野生型DNA的拷贝数计算以此类推,

  根据反应单元形成的方式不同, dPCR主要有微滴和微流控芯片2类。微滴数字PCR(ddPCR, droplet digital PCR,)源于乳液PCR(emulsion PCR)技术。目前应用较多的微滴技术平台有Rain Drop TM数字PCR系统(Rain Dance公司)和QX200系统(Bio-Rad公司)。以QX200系统为例,操作过程中,每个反应准备20微升的反应液,反应液中同时含有针对待检位点突变型和野生型的TaqMan探针(针对突变型和野生型位点的探针携带不同颜色的荧光)、样本(20ng-66ng)、酶、dNTP和缓冲液。反应液混匀后加入微滴发生卡的反应孔中。微滴发生卡如图1所示。该微滴发生卡上有三行孔,分别为顶端孔、中间孔和底端孔。每个中间孔中加入20μl反应液,8个中间孔共可加入8个反应液,即一张载片可同时完成8个反应孔的微滴生成。每个底端孔中加入70μl微滴发生油。同一列的中间孔和底端孔都通过微滴发生卡底部预制的微孔管连接到同一列的顶端孔。将加入反应液和微滴发生油的微滴发生卡放入微滴发生器中,微滴发生器把油和水同时挤进微滴发生卡底下预制的微孔管中,挤出来就形成油包水的乳浊液,进入同一列的顶端孔中。当加入的样本量足够时,一个反应约产生20,000个微滴。将制备好的8个乳浊液分别转至96孔PCR板的8个孔中,封膜后放入普通的PCR仪中扩增。每个微滴进行的PCR反应。如果一个微滴中有一个或更多个突变或野生的待检DNA片段,TaqMan探针就会被酶切,探针上的荧光基团和淬灭基团分离。在后续的流式检测过程中,荧光基团被激发光激发后就会发出不同颜色的荧光。如果微滴中没有突变和野生的待检DNA片段,Taqman探针就不会被切,在后面的检测过程当中,荧光基团即使吸收了激发光的能量,也会被淬灭基团淬灭,不发荧光。PCR循环结束后,将96孔PCR板放入读数仪中。读数时,针把乳浊液吸到扫描仪,乳浊液中的微滴依次通过扫描仪中的毛细管(类似于用流式细胞仪读取细胞的荧光)。读数仪检测1个反应孔全部微滴荧光的时间,大约是2min。因为实验过程中的转管操作、挂壁现象等,会导致一部分微滴损失,读数仪最终读到的微滴数约为14,000~16,000个。

  MALDI-TOF MS通常可以检测500bp片段中98%的SNPs,特别是在检测与鉴定已知SNP位点方面,由于其检测基础是基于核酸片段的量,质谱技术表现出了更大的优势,并且检测时间与检测通量也大大提高。

  Life测序分为文库构建、乳液PCR扩增和可逆性末端边合成边测序三部分。小片段DNA的两端连接上平端接头,构建单链DNA文库。其目标区域基因片段的捕获方法与illumina平台相同。将包含单链DNA文库、5’端标记生物素的接头引物、DNA聚合酶和测序微珠(表面连接有与平端接头互补的引物序列)的水溶液混合均匀后,加入油,油和水混合后形成的每个小微滴中都包含0到若干个文库和测序微珠,每个微滴同时进行的PCR反应,反应结束后,测序微珠上就连接了同一微滴中扩增出来的生物素标记的DNA。微滴结构,加入链霉亲和素标记的磁珠,磁珠会和发生PCR反应的带有生物素的测序微珠结合,富集这些测序微珠,然后通过洗脱液把磁珠富集的测序微珠洗脱下来。 Life 的测序芯片含有数以百万、千万计的小孔。每个小孔既是测序微珠的容器,又是一个微型的pH计。测序时将测序微珠的混悬液从芯片的进口注入,当混悬液流过芯片时,每个测序微珠沉积在1个小孔中。测序时ACGT依次连续流过芯片。如果核苷酸与小孔中的DNA 互补,则该核苷酸与DNA 结合,1焦磷酸,1个焦磷酸被酶进一步分解为2个磷酸 (即两个酸性)。一个测序微珠上有几百、几千条DNA链,因此每次发生聚合反应,每个测序微珠就会出几百、几千个酸性,小孔的pH值下降。芯片中每个小孔中的离子传感器检测到pH 变化后,即刻将化学信息转变为数字电子信息。如果DNA 链含有连续两个相同的碱基,则有双倍的酸性,记录的电压信号也是双倍的。如果碱基不匹配,则无酸性,也就没有电压信号的变化。Rotheel等采用50个肿瘤基因的组合和半导体测序检测了17例转移性乳腺癌患者的肿瘤组织样本和配对血浆样本,结果在9例患者的血浆和组织中检测到了同样的基因突变位点,2例患者的组织中检测到突变,但在血浆中未检测到;2例患者的血浆中检测到突变,但在组织中未检测到。ctDNA检测的阳性一致率为81.8%(9/11),度为66.7%(4/6),ctDNA与肿瘤组织的一致率是76%(13/17)。该研究的低性可能与检测的基因较多以及样本量少有关。

  癌组织基因检测对于指导靶向治疗具有重要意义。2015年2月CFDA批准对吉非替尼说明书的更新,新说明书要求晚期NSCLC患者治疗前应进行组织EGFR突变的检测,但如不可获得或不可获得足够的肿瘤组织时,则可检测血液标本中的ctDNA进行评估,以鉴别出最可能从吉非替尼治疗中受益的NSCLC患者。2015年,《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》也提出当肿瘤组织难以获取时,血液是EGFR基因突变检测合适的替代生物材料,也可作为对可疑组织检测结果的补充。

  我国的癌症发病率和死亡率高,绝大多数癌症患者就诊时已处于中晚期,失去外科手术治疗的机会。驱动基因的检测是晚期癌症患者选择靶向药物的基础,肿瘤组织是靶基因检测的理想标本。常见的获取组织标本的方式包括内镜活检、淋巴结活检、手术切除等。多数晚期患者往往难以接受有创检查,临床很难获得或很难获得足够的肿瘤组织用于基因检测。

  早期肿瘤患者cfDNA含量低,ctDNA丰度低,对检测的灵敏度要求高。虽然NGS在肿瘤早期筛查中的价值并未被看好,但其仍然受到关注。由于不同种类的肿瘤突变谱不同,选择合适的基因组合用于检测是是关键环节之一。选择的基因组合最好能覆盖80%-90%的突变。目前ctDNA应用于肿瘤的早期筛查价值还处在探索中。

  在最近的5年里液体活检和质谱的临床应用医学检验领域的应用研究如雨后春笋。血浆肿瘤游离DNA(ctDNA)、循环血肿瘤细胞(CTC)在肿瘤治疗评效,甚至在早期肿瘤的诊断和复发监测方面具有较好的价值,ctDNA的检测在指导靶向药物应用方面已经得到推荐。超高压色谱质谱(UPLC-MS)在内分泌激素(如皮质醇、醛固酮、儿茶酚氨、活性维生素前体25羟维生素D)、氨基酸分析、新生儿筛查、治疗药物监测、毒物分析等方面的应用越来越多。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在微生物鉴定中已经得到普遍应用,近些年来,其在血浆ctDNA检测和血浆多肽指纹分析里的应用研究也越来越多。在医学会检验分会主委王成彬教授的提一下,第一届长城会议在大会召开的前一天召开CTC前沿技术论坛、ctDNA前沿技术论坛和质谱检测与临床应用论坛。

  微流控芯片技术是一种基于超高密度亲疏水微孔芯片的dPCR 平台。该平台采用包含20,000 个微孔的超高密度芯片作为反应载体。每张芯片只能检测一个样本。芯片表面是疏水的,而芯片的微孔内部是亲水的,这种亲疏水结合的方式可使反应体系进入微孔而不会停留在芯片表面,从而避免了各反应之间的交叉污染。目前采用微流控芯片技术的平台有Bio-MarkTM基因分析系统(Fluidigm公司)和QuantStudioTM 3D数字 PCR系统(Life Technologies公司)。以QuantStudioTM 3D数字 PCR系统为例,操作过程中,每个反应准备16微升的反应混合液,反应混合液中同时含有针对待检位点突变型和野生型的TaqMan探针(针对突变型和野生型的探针携带不同颜色的荧光)、样本(10ng-90ng)、预混液(包含酶、dNTP、缓冲液等)。上样刮板放入自动芯片加载器后,将制备好的反应混合液加至上样刮板上,芯片加载系统中的分配器自动将反应混合液分配至芯片的20,000个孔内。盖上芯片盖,密封芯片。密封后,将芯片放至定制的热循环PCR仪中进行扩增反应。每次可放24张芯片。PCR结束后,将芯片置于读取仪中,所有微孔同时接收激发光的照射并发出野生和突变DNA相应颜色的荧光。读取仪读取一张芯片(即一个反应)的时间约为30秒。

  以突变DNA拷贝数计算为例,上式中λ为每个反应单元含突变DNA的平均拷贝数。P为λ一定时,每个反应单元中含k个拷贝突变D N A 的概率。当k=0 (不含突变DNA ) 时, λ0=1, 0!=1,上式可简化为:

  具体来说,由于组成4种核苷酸量各不相同,因此,采用质谱学方法得到的核苷酸量峰可以直观的了解待测样板中的核苷酸组成谱图上峰值,显示清晰,数据准确,易于辨别。与以往采用的电泳、PCR、测序等方法相比,省略了利用染色-显色,发色基团-激发-显色等方式的多次物理-化学-电信号的,降低了出错概率。

  该技术首先通过多重PCR同时扩增待测基因突变和野生的目的片段,然后加入虾碱酶水解PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和针对待测基因的引物。其后,在反应系统内加入单碱基延伸引物,该引物的3’末端碱基与待检突变位点的前一个碱基互补。采用四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)替代dNTP参加反应。由于ddNTP在脱氧核糖的3’缺少一个羟基,故不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键。这样,探针在突变位点处仅延伸一个碱基,且连接上的ddNTP与突变位点的碱基互补。经树脂纯化后的延伸产物和非延伸引物与芯片基质共结晶,用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜。基质从激光中吸收能量传递给核酸,核酸解吸附并转变为离子。产物离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而测定离子的质荷比(M/Z),从而确定该位点的碱基。

  以往的研究显示年龄、性别、病理类型、T分期、N分期、淋巴结采样数目与NSCLC患者术后的有关,而初始ctDNA的定性和定量检测预测肿瘤患者的研究少见。Kinugasa等采用ddPCR检测了75例Ⅱ-Ⅳ期(Ⅲ-Ⅳ期患者占97%)胰腺癌患者肿瘤组织和cfDNA中的KRAS突变,结果在肿瘤组织和cfDNA中检测到KRAS突变的比例分别为74.7%和62.7%。研究发现组织KRAS基因检测阳性和组织KRAS基因检测阴性的两组患者的OS无统计学差异(351天 vs. 301天),而ctDNA检测阳性患者的OS较ctDNA检测阴性患者的OS短 (413天 vs. 276天)。Sanmamed等采用ddPCR检测19例组织BRAF V600E突变的晚期黑色素瘤患者治疗前外周血中BRAF V600E的浓度(copies/mL),结果在16例患者的外周血中检测到BRAF V600E突变。研究发现OS超过2年的患者,其初治时血浆BRAF V600E浓度较OS短于2年的患者低(27 copies/mL vs. 478 copies/mL)。以216 copies/mL为临界值,ctDNA低于临界值患者的PFS和OS较ctDNA高于临界值的患者长(PFS:9个月 vs. 3个月;OS:27.7个月 vs. 8.6个月)。

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  不同研究中,与组织相比,不同ctDNA检测方法的阳性一致率、阴性一致率和总一致率存在差异,这种差异可能与组织异质性和肿瘤分期(以往的研究,多选择晚期肿瘤的患者)相关。不同ctDNA检测方法针对不同分期的真阳性和真阴性的头对头研究目前未见报道。

  微小残留病灶和复发的早期发现对于复发的早期干预和延长患者时间非常重要。早期肿瘤患者血清肿瘤标志物阳性率低,对于微小残留检测价值有限。肿瘤患者术后的复发监测主要靠影像学,但影像学不能及时地反映患者真实的病情发展情况。液体活检传统,包括ctDNA和循环肿瘤细胞(CTC)在该领域的应用研究成为近2年来的热点,两者在微小残留检测和复发预警中具有潜在的应用价值。ctDNA对于微小残留病灶评估和复发监测研究多集中在直结肠癌和胰腺癌上。

  dPCR通过单PCR反应降低了与突变型DNA有竞争作用的野生型DNA的浓度,其灵敏度可高达0.001%-0.04%。dPCR的灵敏度除了与检测器的灵敏度和PCR扩增效率等因素有关外,还取决于样本总量和可用于反应的单元总数。样本量足够时,可用于反应的单元总数越多,检测的灵敏度越高,准确度也越高。一项前瞻性研究采用ddPCR分析了29例早期乳腺癌患者肿瘤组织和ctDNA中的PIK3CA突变。结果在15例肿瘤组织中检测到PIK3CA突变患者外周血中有14例检测到PIK3CA突变,14例肿瘤组织阴性的患者均未在ctDNA中检测到PIK3CA(灵敏度为93.3%,度为100%)。但dPCR一次只可检测一个已知的突变。若需要检测靶基因的多个突变位点,则需行多次dPCR。例如,需要检测肺癌患者血浆EGFR L858R、19DEL、G719X和T790M 4个位点时,则需进行4次dPCR反应,操作繁琐耗时。

  ctDNA检测前沿技术与应用分论坛分别邀请到上海安可济控股有限公司侯英博士、美国伯乐公司吴非博士和基纳生物技术有限公司和毅新博创公司的陈琛博士分别作“ctDNA在医院实现LDT的难点和解决方案”、“超敏微滴式数字PCR检测技术在循环血肿瘤DNA检测中的临床应用”、“基于核酸质谱的液体活检—数据与案例分享”、“临床质谱在检验医学前沿的研究进展”报告。

  dPCR包括PCR扩增和荧光信号分析两部分。与ARMS检测存在大量cfDNA背景干扰不同,在dPCR扩增前样品被平均分配到几至几百万个单元中。由于每个单元中的靶基因以单状态呈现, 背景干扰少,检测探针的dPCR对于基因突变检出的度显著高于引物扩增的ARMS分析方法。dPCR以反应达到终点时每个反应单元来一种核酸绝对定量技术,可直接数出起始样品DNA的个数。dPCR适合于靠从ct值不可很好分辨的领域及二代测序等位基因频率检测准确性验证。解决了突变与野生基础拷贝数不同而引起的

  靓点1—— “ctDNA步入临床”的标签贴上“循环血肿瘤DNA前沿技术”分论坛

  肿瘤治疗的评效靠影像学的实体瘤疗效评价标准,血清肿瘤标志物的变化与影像学评效的一致率不超过35%。近2年来,已有ctDNA用于晚期肺癌、结直肠癌治疗的耐药预警,较早的相关研究发表于新英格兰医学。该项研究采用靶向或全基因组测序检测了52例正接受性治疗的转移性乳腺癌患者肿瘤基因组改变,采用ddPCR或靶向测序检测组织基因突变阳性患者(以PIK3CA和TP53基因突变居多)血浆中对应基因突变拷贝数的改变。与影像学结果相比,无论用NGS或ddPCR检测得到的ctDNA水平动态改变与肿瘤负荷的改变一致性好,且两者之间的关联性优于CA 15-3及循环肿瘤细胞。

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  NGS可实现对多基因的核酸片段进行高通量平行深度测序,定量检测突变丰度,发现未知突变。cfDNA加入量足够时,NGS的度(0.02%-5%)取决于测序深度。Illumina和Life是目前使用较广泛的测序平台。Illumina测序分为文库构建、桥式PCR扩增和可逆性末端边合成边测序三部分。Illumina测序采用超声或酶切法将待测的基因组DNA样本打断为100-200bp的小片段,这些小片段的两端连接不同的粘性末端接头,构建单链DNA文库。血浆cfDNA不需经过处理,可用于文库的构建。将生物素标记的捕获探针与单链DNA文库混合,目标区域基因片段被杂交到探针上,采用亲和素包被的磁珠捕获杂交到探针上的目标区域基因片段,去除未被吸附的基因片段。将经过富集的目标区域基因片段洗脱下来即可获得目标区域基因片段的DNA文库。文库中具有粘性末端接头与flowcell表面附有的互补探针结合。当含DNA文库的反应液流过flowcell表面时,每条连接有粘性末端接头的单链DNA片段与flowcell表面的接头牢牢结合在一起。每条固定在flowcell表面的DNA片段都经过桥式PCR扩增形成各自的簇,即每个簇都由单个DNA模板的很多个拷贝组成。桥式扩增结束后向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和4种带有荧光标记的dNTP。这些dNTP的3’-OH被叠氮基,不能与下一个dNTP形成磷酸二酯键,因而每次只能添加一个dNTP。dNTP被添加到合成链上后,所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶被水洗脱掉。再加入激发荧光所需的缓冲液,用激光激发荧光信号,光学设备记录荧光信号,计算机分析系统根据四种不同颜色的荧光信号确认碱基种类。荧光信号记录完成后,加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH叠氮基团,dNTP 3’-OH。再加入新的dNTP、 DNA聚合酶和接头引物,进行下一轮测序反应,如此循环,直到记录下每条模板的碱基序列。

  上式中P代表每个反应单元不含突变DNA的概率,可以用野生型反应单元数与反应单元总数的比值来计算。含突变型DNA反应单元荧光信号是可直接读取的,设含突变型DNA反应单元个数为f,n为反应单元总数, 上式可简化为:

  (1大学肿瘤医院检验科,2中日友好医院检验科,3中科院纳米科学中心,4毅新博创生物科技有限公司,5沃特世(上海)科技有限公司,6上海安可济生物科技有限公司)